Главные особенности методики электронной микроскопии определяются
необходимостью помещения объекта исследования внутрь колонны электронного
микроскопа, т.е. в вакуум и обеспечения условий высокой чистоты, так как
малейшие загрязнения могут существенно исказить результаты. Для
просвечивающего электронного микроскопа объект приготовляется в виде тонких
пленок, в качестве которых могут служить различного рода лаки, пленки
металлов и полупроводников, ультратонкие срезы биологических препаратов.
Кроме того, объектами исследования могут быть тонко измельченные
(диспергированные) совокупности частиц. Обычно в просвечивающих
микроскопах, работающих при напряжениях 50-100 кв, толщина объектов не
может превышать 200 А((для неорганических веществ) и 1000 А( (для
органических). Биологические объекты в большинстве случаев приходится
контрастировать, т.е. «окрашивать» (солями тяжелых металлов), оттенять
напылением металлов (платиной, палладием и др.) и использовать ряд других
приемов. Необходимость контрастирования вызвана тем, что большинство
биологических объектов содержит атомы легких элементов (с малым атомным
номером) - водород, углерод, азот, кислород, фосфор и т.д. в то же время
толщина объектов, интересных для биологии и медицины, составляет величину
порядка 50 А(. Без контрастирования при электронно-микроскопических
исследованиях вирусов наблюдаются бесструктурные пятна, а отдельные
молекулы нуклеиновых кислот вообще неразличимы. Использование методов
контрастирования позволяет эффективно применить электронную микроскопию в
биологических исследованиях и в том числе при исследованиях больших молекул
(макромолекул) ( см., например, рис. 7.
Рис. 7. РНК из вируса табачной мозаики (из раствора с ионной силой
0,0003 мкм).
В ряде случаев при исследовании, например, массивных объектов в
технике широкое применение находит метод получения отпечатков, который
заключается в изготовлении и последующем исследовании в микроскопе копий
поверхностей объектов.
Используются как естественные отпечатки (тонкие слои окислов), так и
искусственные, получаемые путем нанесения (напыления, осаждения) пленок
кварца, углерода и других веществ. Наибольшее разрешение ( (10 А()
позволяют получить угольные реплики, которые находят широкое применение как
в технике, так и в биологии.
При наблюдении электронно-микроскопическими методами влажных объектов
( в том числе живых клеток) используются вакуумно-изолированные газовые
микрокамеры. Объекты исследования помещаются в электронных микроскопах на
тончайшие пленки - подложки, которые крепятся на специальных сетках,
изготовляемых обычно из меди электролитическим способом. Эти пленки должны
удовлетворять целому ряду требований, поскольку относительно большая
толщина их, а также сильное рассеяние ими электронов приводят к резкому
ухудшению качества изображения объекта. Кроме того, материал таких пленок
должен обладать хорошей теплопроводностью и высокой стойкостью к
электронной бомбардировке.
Кстати, об электронной бомбардировке объекта исследования и ее
последствиях. При попадании электронов на объект они выделяют энергию,
примерно равную кинетической энергии их движения. В результате могут
происходить местный разогрев и разрушение участков объекта.
Электронный микроскоп часто используется для микрохимического анализа
исследуемого вещества согласно методу, предложенному М. И. Земляновой и Ю.
М. Кушниром. По существу этот метод аналогичен методу микрохимического
анализа с помощью оптического микроскопа. В данном случае электронный
микроскоп используется в качестве устройства, способного обнаружить малые
количества искомого вещества (по форме и структуре кристаллов и т.п.). на
поверхность водного раствора, в котором предполагается наличие искомых
ионов, наносится капля 1 — 1,5% раствора нитроклетчатки в амилацетате.
Капля растекается по поверхности жидкости и образует коллодиевую пленку, на
которую наносится капля реагента. Ионы реагента проникают (диффундируют)
сквозь пленку и, взаимодействуя с раствором, образуют на поверхности пленки
кристаллы, которые содержат ионы, подлежащие обнаружению. После специальной
очистки кусочек пленки с кристалликами помещается в электронный микроскоп,
и на основе изучения этих кристалликов оказывается возможным дать ответ о
наличии искомых ионов, а в ряде случаев — и об их концентрации. Такой метод
микрохимического анализа характеризуется высокой чувствительностью (на 2 —
3 порядка большей по сравнению с другими способами). Например, ионы
марганца могут быть обнаружены в растворе с концентрацией не ниже 10(-11
нормального раствора при содержании иона 10(-11 г (по данным А. М.
Решетникова).
Пути преодоления дифракционного предела электронной микроскопии.
К настоящему времени электронная микроскопия достигла больших успехов
и нашла многочисленные применения. Однако в ряде случаев, о которых кратко
было сказано выше, было бы чрезвычайно желательным добиться дальнейшего
прогресса в электронной микроскопии. Это в первую очередь относится к
проблеме достижения большей разрешающей способности.
На пути решения этой краеугольной задачи стоят чрезвычайно серьезные
технические трудности, связанные с проблемами создания электронных линз, их
взаимного расположения формирования односкоростных электронных потоков.
Совокупность этих факторов приводит в конечном итоге к различного рода
искажениям, играющим важную роль при больших увеличениях и приводящим к
тому, что практически достигаемое разрешение оказывается хуже предельного.
По мере приближения электронной микроскопии к своим предельным
возможностям все труднее и труднее становится вносить в нее дальнейшие
усовершенствования.
Самые последние достижения в электронной микроскопии основаны на
применении новых высоковольтных (V = 100 кв) и сверхвысоковакуумных (вакуум
2e-10 мм рт.(ст.) приборов. Высоковольтная электронная микроскопия, как
показывает опыт, позволяет уменьшить хроматическую аберрацию электронных
линз. В печати сообщается, например, о том, что с помощью нового японского
микроскопа SMH-5 могут быть получены фотографии решеток с межплоскостным
расстоянием (1 А(. Сообщается также, что на новом электронном микроскопе с
ускоряющим напряжением 750 кв получено разрешение, равное 3 А(.
Рассматриваются возможности применения в электронной микроскопии линз
из сверхпроводящих сплавов (например, Hi ( Zn), которые позволят получить
высокие оптические свойства электронных систем и исключительную
стабильность полей. Ожидается, что использование специальных линз-фильтров
позволит получить новые результаты в отражательной электронной микроскопии.
При использовании таких линз в просвечивающем электронном микроскопе
удалось существенно улучшить их разрешающую способность.
В растровых электронных микроскопах просвечивающего типа к настоящему
времени достигнута разрешающая способность в 100 А(. Новый эмиссионный
микроскоп позволяет получать разрешения деталей с размерами от 120 (для
фотоэмиссии) до 270 А( (для вторичной эмиссии).
Вызывает интерес сообщение о том, что голландская фирма Philips вносит
ряд усовершенствований в микроскоп типа EM-300, которые позволят довести
практическую разрешающую способность до теоретического предела (!). Правда,
о существе этих усовершенствований пока не сообщается.
Важность проблемы улучшения разрешающей способности в электронной
микроскопии, приближение ее к теоретическому пределу стимулировала
проведение целого ряда исследований в этой области. Из многочисленных
предложений и идей, зачастую остроумных и весьма перспективных, остановимся
на идеях, высказанных английским физиком Габором, получивших в последние
годы широкое развитие в оптике, радиофизике, акустике, особенно в связи с
созданием оптических квантовых генераторов (лазеров). Речь идет о так
называемой голографии, о которой известно сейчас не только специалистам, но
и всем тем, кто интересуется новейшими достижениями физики. Вместе с тем не
все, наверное, знают, что первые работы Габора по голографии, проведенные
еще в «долазерный» период (1948-1951), были поставлены и выполнены именно в
связи с задачей повышения разрешающей способности в электронной
микроскопии.
Сущность предлагавшегося метода сводилась к следующему.
Монохроматический поток электронов, т.е. поток, содержащий электроны с
одинаковыми скоростями, освещает объект исследования (по схеме
просвечивающего или теневого микроскопа). При этом происходит дифракция
электронов на объекте (вспомним волновые свойства электронов!). Обычно в
электронном микроскопе пучок, претерпевший дифракцию на объекте, поступает
в систему электронных линз, формирующих изображение и обеспечивающих нужное
большое увеличение. Однако эти же линзы, как мы уже отмечали, являются
источниками трудно устранимых искажений, препятствующих достижению
теоретического разрешения. В новом методе предлагалось фиксировать
результат дифракции электронов фотографически в виде дифракционной картины
и подвергать эту картину последующей обработке с помощью оптических
методов, где получение нужных усилений может быть достигнуто с меньшими
искажениями. В таком двухступенчатом процессе получения изображений
основное увеличение достигается за счет перехода от «электронных» длин волн
к оптическим. При этом следует отметить, что обрабатываемая оптическими
методами картина дифракции практически не имеет сходства с объектом
исследования. Однако с помощью светового излучения (видимого) по этой
картине в несложном оптическом устройстве можно восстановить изображение
исследуемого объекта. Для этого источник излучения должен посылать
монохроматические когерентные волны, т.е. должен обладать теми свойствами,
которые так ярко проявляются у оптических квантовых генераторов.
Заметим, что, образно говоря, в этом двухступенчатом процессе мы
фиксируем, «замораживаем» фронт электронных волн и потом воспроизводим его
вновь в виде фронта световой волны в значительно большем масштабе,
используя при этом различие длин волн света и электронов (это соотношение,
например, может быть порядка 6000А(/0,030А( ( 200000).
В таком «безлинзовом», а потому и не вносящим искажений увеличении и
заключается основное достоинство метода голографии в электронной
микроскопии.
К числу новых направлений следует также отнести область микроскопии,
использующую вместо электронов другие виды микрочастиц, тяжелых по
сравнению с электронами. В этом случае дифракционный предел,
предсказываемый теорией, смещен в более далекую область малых размеров.
Примером такого направления микроскопии является развивающаяся автоионная
микроскопия.
В автоионных микроскопах, используемых при исследовании физики
поверхностных явлений, главным образом в металлах, оказывается возможным
видение отдельных атомов. Методика автоионной микроскопии весьма
своеобразна; эта область претерпевает бурное развитие.
Как же далеко мы сможем еще продвинуться по пути раскрытия тайн
микрообъектов? Мы видим, что за исторически короткий срок, используя
новейшие достижения физики и радиоэлектроники, электронная микроскопия
превратилась в мощное орудие исследования природы. Обозримое будущее этой
области науки связано с реализацией дерзновенных проектов создания таких
приборов, которые позволят «приблизить» и сделать зримым многообразный и
красочный микромир. Далеко не всё ещё ясно на этом пути, на котором
постоянно возникают всё более и более сложные научно-технические и
технологические проблемы. Современные приборы микроскопии являются
несравненно более сложными устройствами, чем микроскопы недавнего прошлого.
Уже сейчас мы сталкиваемся с очевидным фактом: приборы микроскопии
становятся всё более сложными и громоздкими по мере проникновения в ранее
недосягаемые тайны мира малых объектов. Дальнейшее усложнение этих
приборов, увеличение затрат на их изготовление определяются необходимостью
разрешения новых всё более сложных проблем.
Здесь уместно провести аналогию с развитием экспериментальной ядерной
физики, где получение информации о свойствах микрочастиц вещества, из
которых состоят ядра атомов, связано с созданием сложнейших и, как правило,
чрезвычайно громоздких и дорогих приборов и установок.
Получение информации, раскрывающей тайны микромира, оплачивается
высокой ценой. Однако происходящие при этом затраты интеллектуальных и
материальных ресурсов, как показывает опыт истории науки, безусловно,
окупаются теми возможностями, которые открываются при этом в технике,
физике, химии, биологии и медицине.
Литература:
13. Рукман Г.И. , Клименко И.С. Электронная микроскопия. М., Знание, 1968.
14. Савельев И.В. Курс физики, т.3. М., Наука, 1989.
Рисунки:
-----------------------
[1] Напомним, что 1(( (ангстрем) = 10e-10 м.
[2] В абсолютной системе единиц коэффициент преломления вакуума равен
единице.
[3] Обратим внимание на то, что масса электрона по данным 1996 г. известна
с относительной погрешностью не более 0,00003, а заряд ( не более 0,00002.
